تشخیص آبستنی بر مبنای میزان غلظت پروژسترون مدفوع در تلیسه ها
خلاصه مقاله :مطالعه حاضر به منظور بررسی امکان تشخیص آبستنی به واسطه اندازه گیری پروژسترون مدفوع در تلیسه های گوشتی و شیری و گاوهای گوشتی صورت پذیرفته است. نمونه های مدفوع که از طریق رکتوم در روزهای ۲۴-۱۸ بعد از تلقیح مصنوعی یا روزهای ۱۷-۱۱ پس از انتقال جنین جمع آوری شده بود ، پس از مخلوط شدن با متانول، آنقدر تکان داده شد تا محلول گشت. بعد از سانتریفیوژ شدن ، مایع شناور سطحی توسط اتر خارج گشت و در پی آن پروژسترون به روش ELISA بررسی شد. تمام گاوهای آبستن غلظت پروژسترون مدفوعی بیش از ng۵۰ در هر گرم مدفوع را در روزهای ۲۴-۱۸ بعد از تلقیح مصنوعی (AI) یا فحلی نشان دادند. با این وجود درگاوهای غیر آبستن میزان غلظت پروژسترون مدفوع بین ۵ تا ng ۱۸۰ در هر گرم مدفوع مشاهده شد. در گاوهای غیر آبستن ، درصد گاوهایی که کمتر از ng/g ۵۰ پروژسترون در هر گرم مدفوع داشتند در مقایسه با تعداد مجموع ۳۷ تا ۶۰% در روزهای ۲۰-۱۸ بود. در حالیکه این مقادیر به بیش از %۷۰ و تا حداکثر ۱/۷۸% در روز ۲۳ افزایش یافتند. زمانیکه cut-off value ، ng ۵۰ در هر گرم در نظر گرفته شد، حساسیت و دقت تستهای مثبت آبستنی کمتر از ۷۰% در روزهای ۲۴-۲۱ و در مورد تستهای منفی آبستنی در روزهای ۲۴-۱۸ ، ۱۰۰% بود و در مورد غلظت پروژسترون مدفوعی گاوهای آبستن و غیر آبستن در روزهای ۲۴-۱۹ تفاوت معنی داری وجود داشت. نتایج فوق حاکی از آن است که مدفوع می تواند جایگزین پلاسما و شیر برای اندازه گیری پروژسترون و تشخیص آبستنی در تلیسه ها و گاوها باشد. رئوس مطالب: ۱- مقدمه ۲- مواد مورد نیاز و روشها ۲-۱- حیوانات و جمع آوری نمونه ها ۲-۲- استخراج پروژسترون و آزمایشات ۲-۳- آنالیز آماری ۳- نتایج ۴- بحث - منابع ۱- مقدمه : تشخیص آبستنی در مدیریت و پرورش گاوها ضروری است و در گذشته از طریق روشهایی همچون : ملامسه از طریق رکتوم درروزهای ۴۰-۳۵ بعد از تلقیح مصنوعی ، تعیین پروژسترون پلاسما یا شیر در روزهای ۲۳-۱۹ بعد از تلقیح، آزمایشات اولترا سونوگرافی در حدود روز ۳۰ بعد از تلقیح و تعیین استرون سولفات شیر بعد از ۱۰۵ روز ، صورت می گرفته است. اگرچه تعیین پروژسترون آنقدر اقتصادی نیست که بجای روش عدم برگشت (به فحلی) و ملامسه از طریق رکتوم استفاده شود ولی ما را قادر می سازد تا مراحل آبستنی را خیلی سریعتر از روش ملامسه از طریق رکتوم تشخیص دهیم. به منظور اندازه گیری پروژسترون ، شیر بدلیل اینکه با روش غیر تهاجمی (non-invasive) از گاوها جمع آوری می شود، نمونۀ مناسبتری نسبت به پلاسما می باشد ولی گرفتن نمونۀ شیر در تلیسه های گوشتی و شیری غیر ممکن است و همچنین جمع آوری شیر در گاوهای گوشتی نسبت به گاوهای شیری نیز مشکلتر می باشد. علاقمندیهای روزافزونی در بکارگیری از آنالیز هورمونهای مدفوع وجود دارد زیرا اولاً به عنوان یک دستاورد ثانویه برای ارزیابی غدد درون ریز می باشد و ثانیاً بخاطر سهولت نسبی جمع آوری نمونه از حیوانات است.حضور مقادیر قابل اندازه گیری از استروئیدهای تناسلی در مدفوع گاو و دیگر حیوانات شناخته شده است. Schwarzenberger در سال ۱۹۹۶ کشف کرد که پروژسترون قبل از دفع مدفوع متابولیزه می شود و پروژسترون متابولیزه نشده فقط در میزان محدودی از مدفوع قابل شناسایی می باشد. بنابراین برای کنترل و تنظیم اعمال جسم زرد، از یک آنتی بادی بر علیه مشتقات پروژسترون(۲۰-oxo-pregnane) استفاده شد. ما همچنین ، برای تعیین مراحل سیکل فحلی از اندازه گیری پروژسترون غیر متابولیزه مدفوعی گاوهای گوشتی استفاده کردیم. با این وجود در مطالعۀ حاضر تلاش کردیم تا از روش تست ELISA برای پروژسترون مدفوعی استفاده کنیم. این امر به ما کمک کرد تا آبستنی را در تلیسه های گوشتی و شیری و گاوهای گوشتی خیلی زودتر تشخیص دهیم. ۲- مواد و روشها ۲-۱- حیوانات و جمع آوری نمونه ها : در مطالعۀ حاضر از تلیسه ها و گاوهای گوشتی سیاه ژاپنی (n= ۳۵, age۱-۹year, parity= ۰-۶) ، دورگه تلیسه ها و گاوهای سیاه ژاپنی و هلشتاین- فیریزین ((n=۱۱, age۳-۹year, parity= ۰-۱ و تلیسه های هلشتاین - فیریزین (تک قلوزا ،یک ساله n=۳۴,) که از مرکز علمی setouchified دانشگاه هیروشیما و فارمهای شیری خصوصی تهیه شده بودند، استفاده شد. گاوها در ارتباط با Animal care/ethics committee (کمیته رفتارشناسی/ مراقبت از حیوانات) دانشگاه هیروشیما تغذیه شدند. از بین گاوها و تلیسه ها ، ۱۵ راس توسط انتقال جنین و مابقی از طریق تلقیح مصنوعی آبستن شدند. در تلیسه ها و گاوهایی که تحت عمل انتقال جنین قرار گرفتند ، نمونه گیری از روزهای پس از فحلی آغاز شد. نمونه های مدفوع تمام گاوهایی که تلقیح مصنوعی شدند در بین روزهای ۲۴-۱۸ و در مورد گاوهایی که تحت عمل انتقال جنین قرار گرفتند در بین روزهای ۱۷-۱۱ جمع آوری شدند. نمونه های مدفوع مخرجی یا مدفوعی که بلا فاصله از روده تخلیه شده بود با دستکش لاستیکی جمع آوری و در کیسه های نایلونی قرار داده شدند و سپس در دمای ۳۰- درجه سانتی گراد تا زمان آزمایش فریز شدند. نمونه های خون نیز در روز ۲۱ از ۱۸ حیوان به منظور مقایسه غلظت پروژسترون خون و مدفوع گرفته شدند. خون مورد نیاز از سیاهرگ دمی توسط لولۀ خلا ۱۰ میلی لیتری هپارینه گرفته شد. پس از سانتریفیوژ شدن با ×g ۱۷۰۰ برای ۱۵ دقیقه ، پلاسمای جدا شده در دمای ۳۰- درجه سانتی گراد تا زمان آزمایش نگهداری شد. ۲-۲- استخراج پروژسترون و آزمایشات : نمونه های مدفوع مورد نیاز همانگونه که در بالا شرح داده شد ، استخراج شدند. آنتی بادی ضد پروژسترون در یک خرگوش تولید شد. پراکسیداز گز کوهی (Horseradish) با کربوکسی متیلوکسیم پروژسترون(سیگما)(progetron carboxy methyloxime) توسط واکنش انهیدرید در هم آمیخته شدند. واکنش متقابل آنتی بادی با پروژسترون ، ۵آلفا پرگناندیون ، ۲۰بتا هیدروکسی پروژسترون ، دی اکسی کورتیکو استرون ، پرگنِنُولون ، ۵ بتاپرگنن-۳آلفا- اُل- ۲۰-۱ و ۱۷ آلفا هیدروکسی پروژسترون به ترتیب ۱۰۰% ، ۸/۵% ، ۷/۰% ، ۶۲/۰% ، ۲/۰% ، ۱/۰% و ۰۵/۰% بود. حساسیت و دقت آزمایش ng۰۰۵۵/۰ به ازای هر میلی گرم برآورد شد. در روزهای ۲۱ تا ۲۴ بعد از آبستنی ، حساسیت و دقت آزمایشات پروژسترون مدفوع در مطالعۀ حاضر ۷۹-۷۱% بود. این نتایج با ۷۲ و ۷۷% که از آزمایشات پروژسترون شیر بدست آمده ، قابل مقایسه بود. بنابراین حساسیت و دقت آزمایشات تشخیص آبستنی با استفاده از نمونه های مدفوع هم تراز استفاده از نمونه های شیر می باشد و در نهایت این نتایج سبب اعتبار آزمایشات پروژسترون مدفوع می شوند. در گاوهای غیر آبستن غلظت پروژسترون مدفوع در روزهای ۲۴-۱۸ کمتر از ng/g۵۰ بود. در نتیجه تمام نمونه های با غلظت پروژسترون کمتر از ng/g۵۰ ، از حیوانات غیر آبستن جمع آوری شده بودند. حساسیت و دقت آزمایشات منفی تشخیض آبستنی در بین روزهای ۱۸ تا ۲۴ ، ۱۰۰% بود. حساسیت و دقت این آزمایشات با ۹۴% از گزارشات Rajamahendran(۱۹۹۳) و به ترتیب با ۹۴ ، ۹۷ و ۱۰۰% گزارشات Grown(۱۹۹۲) ، Penington (۱۹۸۵) ، nakao(۱۹۸۲) در مورد شیر ، قابل مقایسه یا بالاتر بودند. این نتایج بیانگر تشخیص دقیق گاوهای غیر آبستن با استفاده از تعیین میزان غلظت پروژسترون مدفوع در روزهای ۱۸ تا ۲۴ بعد از تلقیح مصنوعی یا فحلی می باشد و بعلاوه تنها یک نمونۀ با غلظت پروژسترون کمتر از ng/g۵۰ برای تشخیص گاو غیر آبستن کافی است حتی اگر نمونه هایی با غلظت پروژسترون بیش از ng/g ۵۰ در روزهای بعد از یک حیوان بدست آید. بیش از ۴۰% گاوهای غیر آبستن در روزهای ۱۸ تا ۲۰ دارای غلظت پروژسترون مدفوعی بیش از ng/g۵۰ بودند ، اگر چه این درصدها در روز ۲۳ به حداقل ۴/۱۹% کاهش یافت. این واقعه احتمالاً بدین علت است که گاوها به علت طولانی شدن فاز لوتئال و یا با مرگ جنین یک جمع شدن تاخیری جسم زرد را نشان دهند و نیز ممکن است ناشی از دفع پروژسترون به مدفوع باشد. مدت زمانیکه طول می کشد تا مواد حاصل از متابولیسم پروژسترون و استروژن بین پلاسما و مدفوع تبادل شود در گاوها و خوک گزارش شده بود. بر طبق گزارشات آیسوب در مورد گاوها ، مدت زمان لازم برای جابجایی پروژسترون پلاسما و مدفوع برای هر گاو متفاوت است (۲- ۰). به علت اینکه غلظت پروژسترون در روزهای ۲۰-۱۸ بعد از تلقیح مصنوعی یا فحلی هنوز در حال افزایش است ، تشخیص آبستنی باید در حدود روز ۲۳ بعد از باروری صورت گیرد. راه حل دیگر می تواند ارزیابی غلظت پروژسترون مدفوع در روزهای بعد مثلاً روزهای ۲۷ و ۲۸ باشد. نمونه برداری در روزهای متفاوت اگرچه نیازمند زمان و کار بیشتری است ولی باعث افزایش دقت تشخیص آبستنی می شود. هنگامیکه غلظت پروژسترون مدفوع و پلاسما مقایسه شد ، در ۵ راس از ۱۱ گاو غیر آبستن میزان غلظت پروژسترون هم در پلاسما و هم در مدفوع کاهش پیدا کرده بود. این حقیقت ممکن است بدلیل یک فاز لوتئالی کوتاه همراه با تخمک گذاری باشد. بعلاوه در ۴ راس از گاوهای غیر آبستن غلظت پروژسترون پلاسما در سطح بالا رونده باقی ماند. این گاوها ممکن است یک فاز لوتئالی طولانی یا جنین مرده داشته باشند. متوسط غلظت پروژسترون مدفوعی گاوهای آبستن از روز ۲۰ تا ۲۴ به دلایل نامعلومی کاهش یافت. کاهش غلظت پروژسترون شیر در گاوهای غیر آبستن در حدود روز ۲۱ در مطالعات دیگر مشاهده شده بود. تلیسه ها و گاوهایی که دارای پروژسترون مدفوعی بیش از ng/g۵۰ بودند ، آبستن در نظر گرفته شدند. هچنین برای تشخیص مرحلۀ آبستنی ، نتایج بدست آمده با نتایجی که دامپزشکان با تجربه از طریق روش ملامسه از طریق رکتوم در روزهای ۴۰-۳۰ بدست آورده بودند ، مقایسه شد. ۲-۳- آنالیز آماری : تفاوتهای میان غلظت پروژسترون مدفوعی بین گاوهای آبستن و غیر آبستن در روزهای بعد از تلقیح مصنوعی و فحلی توسط ANOVA دوطرفه و به دنبال آن توسط تست Duncan’s آنالیز شد. با این وجود از یک آزمون یک طرفه ANOVA برای ارزیابی غلظت پروژسترون مدفوعی بین نژادها استفاده شد. از آزمون مربع کای برای معنی دار کردن درصد گاوهای دارای پروژسترون مدفوعی بیش از ng/g ۵۰ در روزهای بعد از تلقیح مصنوعی یا فحلی ، استفاده شد. به امکان کمتر از ۰۵/۰ بطور واضح و متفاوتی پرداخته شد. ۳- نتایج : تمام حیواناتی که متعاقباً آبستن تشخیص داده شدند ، مدفوعی با غلظت پروژسترون بیش از ng/g ۵۰ در روزهای ۲۴- ۱۸ تولید کردند. با این وجود حیواناتی که متعاقباً به عنوان غیر آبستن شناخته شدند دارای غلظت پروژسترون مدفوعی بین ۵ و ng ۱۸۰ به ازای گرم مواد مدفوعی دارا بودند. تمام گاوهای با غلظت پروژسترون مدفوعی کمتر از ng/g ۵۰ غیر آبستن بودند. غلظت پروژسترون مدفوعی ng/g ۵۰ به عنوان cut-off value برای تشخیص آبستنی محاسبه شد. اطلاعات مربوط به حساسیت و دقت آزمایشات آبستنی مثبت و منفی در روزهای مختلف در جدول ۱ گنجانده شده است. تشخیص آبستنی مثبت در روز ۱۹ ، کمتر از ۶۵% بود که این نتایج در روزهای ۲۴-۲۱ تا بیش از ۷۰% افزایش یافت. هیچ تفاوت آشکاری در حساسیت و دقت آزمایشات مثبت تشخیص آبستنی در بین روزها وجود نداشت(۰۵/۰ > P) . حساسیت و دقت تشخیص گاوهای غیر آبستن در طول روزهای ۱۸ تا ۲۴ ، ۱۰۰% بود. جدول ۱ : حساسیت و دقت تشخیص آبستنی بر مبنای غلظت پروژسترون مدفوعی گاوها
|
آبستنی
|
حساسیت و دقت (%) در روزهای بعد از تلقیح مصنوعی یا فحلی
|
نتایج
|
|
|
۱۸
|
۱۹
|
۲۰
|
۲۱
|
۲۲
|
۲۳
|
۲۴
|
|
|
|
|
منفی
|
۱۰۰
(۳/۳)
|
۱۰۰
(۶/۶)
|
۱۰۰
(۱۳/۱۳)
|
۱۰۰
(۲۰/۲۰)
|
۱۰۰
(۲۲/۲۲)
|
۱۰۰
(۲۵/۲۵)
|
۱۰۰
(۱۰/۱۰)
|
۱۰۰
(۹۹/۹۹)
|
غلظت پروژسترون مدفوعی ng/g ۵۰ به عنوان cut-off value برای آبستنی محاسبه شد. مدفوع گاوهای آبستن دارای غلظت پروژسترون بیش از ng/g ۱۰۰ در روزهای ۲۱-۱۹ بود که یک کاهش تدریجی را از روزهای ۲۲ تا ۲۴ بدنبال داشت. غلظت پروژسترون مدفوعی در روزهای ۲۳ و ۲۴ در مقایسه با مقدار در روزهای ۲۰ و ۲۱ به صورت آشکاری کاهش پیدا کرد. در گاوهای غیر آبستن افزایش آشکاری در غلظت پروژسترون مدفوعی روز ۱۹ در مقایسه با مقدار آن در روز ۱۸ مشاهده شد و بعد از آن غلظت پروژسترون مدفوعی تا روز ۲۴ به آرامی کاهش پیدا کرد. گاوها به طور آشکاری پروژسترون مدفوعی کمتری را در روزهای ۲۳ و ۲۴ در مقایسه با روزهای ۲۱-۱۹ داشتند. تفاوت آشکاری در غلظت پروژسترون مدفوع در بین گاوهای آبستن و غیر آبستن در روزهای ۲۴-۱۹ وجود داشت. هیچ تفاوت آشکاری در پروژسترون مدفوعی بین نژادژاپنی سیاه ، حیوانات دورگه و هلشتاین-فیریزین در هر دو مورد آبستن و غیر آبستن وجود نداشت. پس از جمع آوری نمونه های مدفوع و پلاسما هر گاو در روز ۲۱ بعد از تلقیح مصنوعی یا فحلی ، نتایج با یکدیگر مقایسه شد. از ۱۸ راس گاو ، ۷ راس با غلظت پروژسترون پلاسمای بیش از ng/ml ۱ و غلظت پروژسترون مدفوعی بیش از ng/g۵۰، آبستن تشخیص داده شدند. در ۵ راس گاو غیر آبستن ، هم غلظت پروژسترون پلاسما و هم مدفوع پائین بود (به ترتیب کمتر از ng/ml ۱ و کمتر از ng/g ۵۰). در ۴ راس گاو غیر آبستن غلظت پروژسترون مدفوعی و پلاسمایی بالایی داشتند با این وجود در ۲ راس گاو غیر آبستن دیگر ، غلظت پروژسترون مدفوع کمتر از ng/g ۵۰ ولی غلظت پروژسترون پلاسما بیشتر از ng/ml۱ بود. ۴- بحث : اخیراً آنزیم ایمنی سنجی (ELISA) را برای پروژسترون مدفوع ایجاد کردیم که می تواند برای تشخیص زمان شروع سیکل فحلی در گاوهای گوشتی کاربردی باشد. این آزمایش فقط پروژسترون غیر متابولیزه را کشف می کند ، نه دیگر متابولیتهای پروژسترون ، و امکان اندازه گیری عملی پروژسترون مدفوع را فراهم می آورد. زیرا از لحاظ اقتصادی کیتهای پروژسترون در دسترس بوده و می تواند برای اندازه گیری مورد استفاده قرار گیرد. مطالعۀ حاضر به منظور بررسی امکان تشخیص آبستنی به واسطه اندازه گیری پروژسترون مدفوع در تلیسه های گوشتی وشیری و گاوهای گوشتی صورت پذیرفته است. تصور می شد که اجزا مدفوع در ارتباط با شرایط غذایی تغییر پیدا کند بنابراین دراین مطالعه تلیسه ها و گاوهای مزارع مختلفی به خدمت گرفته شدند. در حال حاضر اثر متقابل غلظت پروژسترون مدفوعی با رژیم مشخص نمی باشد. با این وجود حساسیت و دقت آزمایشات منفی تشخیص آبستنی از روزهای ۱۸ تا ۲۴ ، ۱۰۰% بود. اثر رژیم غذایی در غلظت پروژسترون مدفوع ممکن است محدود باشد و نیازمند آزمایشات پر هزینه تری است. بطور کلی ، این نتایج بیان می کند که آزمایش پروژسترون مدفوع ، مانند آزمایش پروژسترون شیر ، برای تشخیص تلیسه ها و گاوهای غیر آبستن در حدود روز ۲۳ بعد از تلقیح مصنوعی یا فحلی کاربردی می باشد و از لحاظ اقتصادی نیز در دسترس بودن کیتهای پروژسترون همراه با این روش برای مشخص کردن غلظت پروژسترون مدفوع به منظور کنترل آبستنی می تواند مورد استفاده قرار گیرد. ترجمه : محمّد ملکان عضو باشگاه پژوهشگران جوان و انجمن علمی دامپزشکی زیر نظر: دکتر مهران فرهودی مقدم استادیار بخش مامایی و بیماریهای تولید مثل دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرج - منابع : - N. Isobe , M. Akita ,T. Nakao , H. Yamashiro and H. Kubota , ۱۷ february ۲۰۰۵ , pregnancy diagnosis based on the fecal progesterone concentration in beef and diary heifers and beef cow , animal reproducting science , ۲۰۰۵.۰۲.۰۰۴
