دریافت قیمتها در تلگرام

سروش

فائو یا سازمان خواربار و کشاورزی ملل متحد

بورس جهانی شیکاگو

بورس جهانی شیکاگو

پروماک

مرغک

آویژدانه

فید ماشین

طیوران ابزار

افرند توسکا

سیانس

بیکداچمن

دانلود آهنگ

 تشخيص دقيق تر آلودگى هاى مايکوپلاسمايى در طيور
 

تشخيص دقيق تر آلودگى هاى مايکوپلاسمايى در طيور

 

مقدمه

براى اجراى برنامه هاى کنترل مايکوپلاسما به آزمايش هايى با ويژگى بالا به همراه حساسيت کافى و نمونه گيرى مکرر نياز است واکنش هاى مثبت کاذب قادرند تا خسارات جدى به بار آورند به طورى که منجر به حذف يک گله غير آلوده شو ند و درنتيجه از ميزان مقبوليت برنامه ى پيشگيرى بکاهند . با اينحال آلودگى هاى تشخيص داده نشده ى اخير خطر انتشار آلودگى را به ساير مزارع از طريق انتقال عمودى يا افقى افزايش مى دهند تعيين عفونتى که به تازگى رخ داده است بستگى زيادى به تکرار نمونه گيرى تعداد نمونه اخذ شده و حساسيت آزمايش انجام گرفته دارد . هيچ گونه آزمايش سرولوژيک با حساسيت و ويژگى صد در صد وجود ندارد در واقع حساسيت و ويژگى رقيبان يکديگرند . افزايش حساسيت يک ازمون از ويژگى آن خواهد کاست بنابراين هميشه يک آزمايش به صورت توافقى انتخاب مى شود و مبناى کار قرار مى گيرد . پيش از آنکه بتوانيم نتايج آزمايش هاى سرولوژى را تفسير کنيم بايد مجموعه اى حاوى تعداد زيادى از داده ها در اختيار مان باشد بدون اين داده ها تفسير نتايج عملى حساس و خطرناک خواهد بود بخشى از داده هاى مورد نياز از بيرون و قسمتى از داخل آزمايشگاه به دست مى آيند .

اطلاعات حاصله از بيرون آزمايشگاه

·        نمونه بردارى از کدام حيوانات (پرندگان ) يا موادى صورت گرفته است ؟

·        نمونه ها در کدام مرحله از بيمارى يا آلودگى اخذ شده اند ؟

·        تعداد نمونه ؟

·        ميزان شيوع مورد انتظار عفونت ؟

·        آيا طيور واکسينه شده بودند ؟ بلى يا خير؟ چه وقت ؟با کدام واکسن ؟ روش واکسيناسيون؟

·        سن پرندگان ؟ وضعيت آنتى بادى هاى مادرى آنها ؟



تابلو 1- تعيين حساسيت گله


                                            تعداد نمونه ها = n              n (p-1)-1 = حساسيت گله


به طورى که :

                                        (ويژگى -1) * (ميزان شيوع -1 ) + (حساسيت * ميزان شيوع ) = P


مثال :

اگر حساسيت (براى يک نمونه ) 90 درصد و ويژگى 99 درصد باشد براى تعداد 10 نمونه و با يک ميزان شيوع 10 درصد حساسيت گله برابر خواهد بود با :65% ( 65 درصد)


داده هاى آزمايشگاهى

·        آزمايش قرار است چه چيزى را تعيين کند (igm  ، igG ، پادتن هاى رسوب دهنده و غيره )؟

·        حساسيت آزمون ؟ زمان بين آلودگى و تغييرات سرمى مورد انتظار؟

·        ويژگى آزمون ؟

·        از اين مقادير پيش بينى نتايج آزمايش حساسيت و ويژگى گله قابل استنباط خواهد بود رابطه ى حساسيت ، ويژگى ، ارزش پيش بينى و ميزان شيوع ( درصد پرندگان آلوده ) در تابلو يک شرح داده شده است :

حساسيت

حساسيت درصدى از پرندگان آلوده است که توسط آزمايش قابل تشخيص است و به صورت aa+c نمايش داده مى شود يک نتيجه ى منفى کاذب به دست امده از بررسى سرمى مايکوپلاسما ، جواب آزمايشگاهى منفى براى نمونه اى است که از يک پرنده آلوده تهيه شده است دلايل ممکنه براى بروز چنين حالتى عبارتند از :

·        خود آزمايش ميزان حساسيت نيست .

·        زمان نمونه بردارى پس از آلودگى هنوز زود بوده است .

نتايج آزمايشگاهى



جدول 1- رابطه بين حساسيت ، ويژگى ، ارزش پيش بينى وميزان شيوع


 


آيا پرنده آلوده است ؟


 


 


خير


بلى


 


a+b


b


a


مثبت


نتايج

آزمايشگاهى


c+d


d


c


منفى


       c+d a+b+


b+d


a+c


 


 

پرندگانى که به طور انفرادى با mg يا ms تلقيح شوند اغلب سطح قابل اندازه گيرى از آنتى بادى ها را بعد از يک هفته ( آزمايش RPA يا آگلوتيناسيون سريع روى پليت تعدادى از کيت هاى ELISA ) تا 5/1 هفته (آزمايش HI ) نشان مى دهند . با وجود اين در عمل و در شرايط گله آلودگى مايکوپلاسمايى در يک آشيانه قبل از آنکه تشخيص داده شود از اولين طيور آلوده به سايرين انتقال مى يابد و منتشر مى شود که اين امر منجر به تاخيرى در تعيين آنتى بادى ها در سطح گله خواهد شد زمان بين آغاز آلودگى در بعضى پرندگان و تشخيص پادتن ها در سطح گله به راحتى مى تواند تا 3 هفته هم طول بکشد . هنگامى که طيور جديداً آلوده شده با يک آنتى بيوتيک درمان مى شوند تا از انتشار سويه ى مايکوپلاسما در ميان گله کاسته شود تعداد پرندگان آلوده مى تواند موقتاً پايين بماند که اين شانس تشخيص را در آن برهه ى زمانى کاهش مى دهد .

·        هيچ گونه پاسخ ايمنى هر مورال قابل اندازه گيرى وجود ندارد .

- همه ى سويه هاى مايکوپلاسماها سطح يکسانى از پاسخ ايمنى هر مورال القا نمى کنند سويه اى تخفيف حدت يافته پاسخ ايمنى کمترى از سويه اى اصلى مزرعه ايجاد مى کنند در ميان مقالات گزارش هايى از سويه هاى به اصطلاح غير مشخص به چشم مى خورد حاکى از آن که سويه ها در آزمايش هاى RPA ، HI و ELISA ردى از خود به جا نمى گذارند : وليکن با حساسيت پايين ترى مى توان آنها را با کشت و يا در آزمايش PCR يافت .

- آزمايش HI نسبت به سويه اختصاصى عمل مى کند.

- نمونه ديگرى از سطح بسيار پايين و غير قابل تشخيص پاسخ هاى هر مورال مى تواند به همراه بعضى از واکسن هاى زنده تخفيف حدت يافته مشاهده شود.

قبل از انجام آزمايش پاسخ ايمنى کاهش پيداکرده است . استفاده از اغلب واکسن هاى کشته Mg منجر به ايجاد سطوح بالاى تيتر در ازمايشگاه هاى RPA و HI در نخستين ماه هاى بعد از واکسيناسيون مى وشد در طى دره تخمگذارى اين تيترها به سطح پايينى تقليل مى يابند بخشى از اين گله ها حتى ممکن است دوباره از لحاظ سرمى منفى شوند.

با استفاده از اين تجربيات گله هاى واکسينه اى که در انتهاى دوره ى تخمگذارى هنوز عيار آنتى بادى بالايى دارند مظنون به اين هستند که آلودگى در آنها موجب يادآورى پاسخ ايمنى شده است .

·        اثر Prozone يا اثر Dose-Hookhigh :

اين اثر توسط سطح بسيار بالاى پادتن هايى ايجاد مى شود که به سرولوژى مايکوپلاسما مربوط نيستند.

ويژگى

ويژگى درصد پرندگان غير آلوده است که نتيجه ى آزمايش منفى دارند وبه صورت db+d نمايش داده مى شود يک نتيجه ى مثبت کاذب در بررسى سرمى مايکوپلاسماها يک پاسخ آزمايش مثبت از نمونه اى است که به يک پرنده ى غير آلوده تعلق دارند دلايل احتمالى چنين وضعى شامل مواردزير است :

·        خود آزمايش : به عنوان مثال کيفيت آنتى ژن کيفيت مجموعه ى مورد استفاده در آزمايش ثبات مواد مورد استفاده در آزمايش تا پايان مهلت انقضا .

نحوه ى انجام آزمايش زمانى استفاده از سرم هاى رقيق دشه توصيه مى شود که آزمايش RPA به کار رود.

·        کيفيت سرم : کيفيت نازل سرم مى تواند موجب افزايش تعداد پاسخ هاى مثبت کاذب شود سانتريفوژه اين سرم ها ممکن است به کاهش اين مشکل کمک کند.

·        سرم هاى منجمد : سرم هايى که منجمد شده اند مى توانند در ازمايش هاى RPA جواب هاى مثبت کاذب نشان دهند بنابراين زمانى مى توان از اين آزمايش ها استفاده کرد که نتايج منفى باشند . اگر پاسخ هاى RPA حاصله از اين سرم ها مثبت باشند لازم به نظر مى رسد که با استفاده از آزمون ديگرى مجدداً بررسى شوند .

·        واکنش هاى متقاطع با آلودگى ناشى از عامل ديگرى که آنتى ژن هاى مشترک دارند مايکوپلاسماهاى گالى سپتيکوم ، سينوويه و ايميتانس نسبت هاى آنتى ژنى دارند به ويژه در طول فاز حاد يک عفونت مايکوپلاسمايى ، واکنش هاى متقاطع را ميتوان در آزمايش هاى انجام يافته بر روى گونه هاى مايکوپلاسماى داراى قرابت ديد بنابراين در طى يک درگيرى حاد با مايکوپلاسما سينوويه يا ايميتانس ، آزمايش هاى سرمى Mg ممکن است تا اندازه اى واکنش هاى متقاطع نشان دهند به طور متوسط تست هاى سرولوژيک بررسى Mg و Ms در سرم هاى پرندگانى که به تازگى با يک سويه ى هترولوگ مايکوپلاسما آلوده شده اند نسبت به سرم هاى پرندگان غير آلوده نتايج مثبت کاذب بيشترى نشان مى دهند .

·        سرم هاى به دست آمده از طيور مسن تر : مشخص شده است که پرندگان مسن تر عوامل غير اختصاصى زيادترى از پرندگان جوان در سرم خونشان وجود دارد تصور مى شود IgG طيور يا يک پروتئين مثل عامل روموتوئيد موجب بيشتر واکنش هاى غير اختصاصى در طيور مسن تر مى شود غير فعال کردن سرم ببا حرارت دادن منجر به تغيير ماهيت ايمنوگلوبولين هاى غير اختصاصى مى شود و از اين طريق ميتوان به کاستن از واکنش هاى غير اختصاصى به ويژه در ازمايش RPA کمک کرد.

·        واکسن هاى کشته که اخيرا مصرف شده باشند در برخى گله هايى که به تازگى يک واکسن کشته دريافت کرده اند ممکن است در بررسى سرمى مايکوپلاسما موقتا مشکلى با پاسخ هاى مثبت کاذب ديده شود . اين واکنش ها معمولا در فاصله زمانى بين هفته هاى 2 تا 6 پس از آن ناپديد مى شوند

·        پل زدن يعنى چسبيدن غير اختصاصى سرم به گوده ى پليت : استفاده از سرم هاى داراى چربى بالا مى تواند مو جب افزايش تعداد نتايج مثبت کاذب شود.

با نگاه به فهرست دلايل احتمالى واکنش هاى مثبت کاذب ممکن است شخص از اين تعجب کند و در ذهنيت اونگنجد که هنوز گله هاى منفى از لحاظ سرمى وجود دارند. در سال 2001 براى تعيين ويژگى آزمايش RPA براى Mg و Ms مطالعه اى در آلمان بر روى 66506 سرم جدا شدهاز نمونه هاى فيلد انجام گرفت و ويژگى آزمايش RPA براى Mg با استفاده از سرم رقيق نشده و رقت هاى 12 ، 14، 18 بررسى و نشان داده شد که اين پارامتر به ترتيب 7/95 ، 1/99 ،6/99، 9/99 درصد براى سرم هاى فوق الذکر است براى آزمايش RPA براى Ms با استفاده از 393/22   سرم جدا شده از نمونه هاى فيلد ويژگى آزمون براى سرم رقيق نشده رقت هاى 12 ، 14 ، 18 به ترتيب برابر 6/97 ، 99 ، 7/99 ، 9/99 درصد تعيين شد. اين اطلاعات توصيه ى oie مبنى بر استفاده از سرم هاى رقيق شده را براى سرولوژى مايکوپلاسماها توجيه مى کند.

مثبت هاى کاذب مشکوک

بيشتر واکنش هاى متقاطع و پاسخ هاى مثبت کاذب ناشى از کاربرد اخير واکسن هاى کشته ضعيف و موقت هستند . بررسى مجدد همان نمونه ها با همان تست آزمايشگاهى براى حل مشکل اين نتايج مثبت کاذب اکثرا بى فايده است . يک راه حل بهتر براى کاهش تعداد نتايج مثبت کاذب آزمايش مجدد سرم هاى داراى نتيجه مثبت با يک روش آزمايشگاهى ديگر است که به ان تست تاييدى هم گفته مى شود اين آزمون دوم حداقل بايست به همان حساسيت اولى و آزمونى مستقل باشد به عنوان مثال آزمايش RPA و تست HI ( Mg ) يا ELISA .

راه حل دوم نمونه گيرى جديد از گله است اين مى تواند شامل نمونه هاى جديد خون باشد ولى همچنين مى تواند سوآبهاى ناى براى آزمايش PCR هم باشد زمانى که واکنش هاى متقاطع و واکسن هاى غير فعال شده عامل بروز مسايل باشند تيترها معمولا پس از چند هفته افت خواهند کرد.

تعداد نمونه

براى تشخيص سريع آلودگى هايى که اخيرا اتفاق افتاده اند از طريق سرولوژى تکرار نمونه بردارى تعداد نمونه وفاصله زمانى بين آلودگى و تغييرات سرمى مورد انتظار فاکتورهاى مهمى به شمار مى ايند براى پى بردن به وجود آلودگى جديد آزمايش يک پرنده به طور روزانه بهتراز آزمايش تمام پرندگان به صورت يک بار در سال است تکرار بيشتر نمونه بردارى توسط زمان بين آلودگى و تشخيص را کوتاه تر ميکند. در موارد آلودگى ها ى مايکوپلاسمايى جديد تعداد نسبتا ً زياد نمونه لازم است تا قادر باشيم آلودگى هايى را که هنوز ميزان شيوع پايينى دارند تشخيص دهيم اين تعداد نسبتاً زياد نمونه ها آزمايشى با ويژگى فوق العاده را طلب مى کند تا ويژگى گله را در سطح قابل قبولى حفظ کند.

حساسيت گله

حساسيت گله عبارت است از شانس تعيين يک آلودگى درگله به طورى که حداقل يک نمونه مثبت باشد به سادگى قابل درک است که نمونه هاى بيشتربه معناى قائل شدن احتمال بيشتر براى تشخيص است .

ويژگى گله

ويژگى گله عبارت است از شانس اينکه در يک گله غير آلوده تمام نمونه هاى مورد آزمايش منفى باشند انجام آزمايش بر روى تعداد نمونه بيشتر منجر به افزايش خطر داشتن يک پاسخ مثبت کاذب يا بيشتر از ان مى شود.  

ويژگى گله برابر است با :

                                                                                       n (specificity ) = ويژگى گله

به طورى که n تعداد نمونه هاست . مثلاً اگر ويژگى براى يک نمونه 99 درصد باشد ويژگى گله براى 60 نمونه برابر است با : 55 % = 60 (990/0 ) بدين معنا که در اين شرايط تنها 55 درصد از گله هاى غير آلوده نتايج فقط منفى خواهند داشت و 45 درصد ديگر اين گله ها نتايج مثبت کاذب به تعداد يک يا بيشتر خواهند داشت بنابراين اخذ نمونه هاى بيشتر نه تنها شانس تشخيص آلودگى را بالا مى برد بلکه احتمال نتايج مثبت کاذب را هم افزايش مى دهد وقتى که ميزان شيوع آلودگى درگله پايين است تعداد زيادى نمونه بايد اخذ شود که در اين صورت ويژگى گله کاهش خواهد يافت . بنابراين تعداد نمونه ها را بايست به دقت مورد بررسى قرارداد نه خيلى کم ونه چندان زياد البته اين نکته فهم آسانى دارد وليکن انجام دادن آن دشوار است فرمول و روش محاسبه تعداد نمونه موردنياز به صورت نمونه بردارى تصادفى براى تعيين عفونت با قطعيت 95 درصد قطعيت جهت گله هاى با تعداد مشخص و ميزان شيوع معين نشان مى دهد تعيين يک آلودگى جديد با Mg يا Ms که هنوز ميزان شيوع پايينى دارد به نمونه هاى زيادترى نيازمند است تا يک آلودگى قديمى با ميزان شيوع بالا که درصد زيادى از پرندگان آلوده اند پس براى يک برنامه کنترل مراقبت از مرغ هاى مادر معمولا ً نمونه هاى بيشترى اخذ مى شود تا بررسى وضعيت گله هاى تخمگذار پير.

نتيجه گيرى

آزمايش خون ابزارى مهم براى تشخيص عفونت هاى مايکوپلاسمايى است چندين سيستم بررسى کننده را مى توان به کاربرد که هيچ يک بر ديگرى ارجحيتى ندارد اگر چه ممکن است ميزان نتايج مثبت کاذب در ميان آزمايش هاى سرولوژى مختلف به طرزمعنى دارى متفاوت باشد با اين حال در هر آزمايش مى توان سطح معينى از پاسخ هاى مثبت کاذب را انتظار داشت بنابراين توصيه مى شود که فقط روى يک آزمون به تنهايى متکى نبوده وبه آن اطمينان کامل نداشته باشيم استفاده از يک آزمايش تاييد کننده موکداً سفارش مى شود مهم است که از انتخاب يک آزمايش يا تفسير نتايج حاصل از يک آزمايش خاص بدون دانستن عملکرد فنى آن اجتناب شود و همچنين اهميت دارد که امکان استفاده از سيستم هاى آزمايشى ديگرى هم به عنوان جايگزين داشته باشيم علاوه بر يک قسمت تاييدى سرولوژيک به کار بردن آزمايش PCR در برنامه هاى کنترل مايکوپلاسما مى تواند بسيار مفيد و موثر باشد . در مواردى که پاسخ هاى سرمى مثبت يا مشکوک در گله اى که سابقاً عارى از مايکوپلاسما بوده است به دست مى آيد به کمک بررسى سوآبهاى نامى با روش PCR ميتوان وضعيت واقعى و فعلى آن گله يا گله هايى را که در مجاورت آن هنوز از لحاظ سرمى منفى هستند سريعا تاکيد کرد با اين حال از آنجا که ازمونهاى PCR هم کامل نيستند موقعيت هايى به وجود مى ايند که کشت وتعيين تيپ سويه هاى مايکوپلاسما توسط ازمايش هاى معمول از قبيل IFA ضرورت مى يابد.



تابلو2- طريقه محاسبه تعداد نمونه هاى لازم


که به موجب آن :

n : تعداد نمونه هاى مورد نياز

95/0 : قطعيت لازم ( انتخاب شده ) معادل 95 درصد براى تشخيص آلودگى

D : تعداد حيوانات (طيور) آلوده

N : تعداد کلى حيوانات (طيور) شامل گروه ، آَشيانه ، مزرعه

مثال : در مورد يک گله 10000 تايى طيور که 10 درصد آن با Mg آلوده باشد .


 

مختصر و شايد مفيد !

·        هيچ تست کاملى وجود ندارد حتى الامکان از يک روش مناسب استفاده شود که زمان زيادى نگيرد.

·        براى تشخيص عفونت هاى جديد اخذ 60 نمونه توصيه مى شود.

·        تکرار نمونه گيرى بسيارمهم است تا در زمان مناسب آلودگى هايى را که به تازگى رخ داده اند بيابيم .

·        هرچه تعداد نمونه زيادتر باشد پاسخ هاى مثبت کاذب هم بيشتر خواهند بود بنابراين شايسته است از يک آزمون تاييد کننده استفاده شود .

·        توليد آنتى بادى به زمان نياز دارد يک هفته براى يک پرنده و 3 هفته براى کل گله .

·        براى تشخيص هاى خيلى زود به ويژه آَشيانه ها يى که در نزديکى آشيانه جديداً مبتلا شده واقعند استفاده از PCR مى تواند بسيار مفيد باشد.

·        در طى فاز حاد عفونت درمان با آنتى بيوتيک ها ميتواند پاسخ سرولوژيک گله را به تاخير بيندازد.

·        سويه هايى وجود دارند که تشخيص آنها با هرگونه آزمايش مشکلتر از سايرين است .

·        براى واريانت هاى آنتى ژنى ، سويه هاى نامشخص سويه هاى باتوان ايمنى زايى کم ، مايکوپلاسما ايميتانس کشت يا PCR مى تواند بسيار کمک کننده باشد .

·        اعتماد و تکيه بر روى يک آزمايش تنها يک اشتباه است و بس .

 

دنياى کشت وصنعت

دکتر محمد عبدالشاه – دامپزشک مزرعه مرغ مادر